细胞转染干货分享：实验成功的关键技巧
1. 选择合适的转染方法
根据细胞类型和实验目的，选择最适合的转染方法：
| 转染方法 | 适用细胞 | 优点 | 缺点 |
|---|---|---|---|
| 阳离子脂质体（Lipofectamine 3000, LTX, RNAiMAX等） | 贴壁细胞（如HEK293, HeLa, A549, MCF-7） | 高效、温和、易操作 | 适用范围有限，部分细胞毒性 |
| 聚乙烯亚胺（PEI） | 悬浮细胞、病毒包装（HEK293T） | 便宜，稳定性好 | 低转染效率，需优化 |
| 电转（Electroporation） | 难转染细胞（T细胞、干细胞） | 高效，不依赖细胞类型 | 毒性高，细胞存活率低 |
| 病毒介导（慢病毒、腺病毒、AAV） | 任何细胞，特别是难转染细胞 | 稳定表达，高转染效率 | 制备复杂，时间长 |
✅ 推荐：
- 贴壁细胞：Lipofectamine 3000 / PEI
- 悬浮细胞：PEI / 电转
- 原代细胞：病毒介导（慢病毒、腺病毒）
- 基因编辑（CRISPR）：Lipofectamine / 电转 / 慢病毒
2. 关键实验参数优化
想提高转染效率？这些因素必须关注！
（1）DNA或RNA质量
- 高纯度DNA（A260/A280 ≈ 1.8，A260/A230 > 2.0）
- 无内毒素（可用内毒素去除试剂）
- 线性化DNA通常比超螺旋DNA转染效率高
（2）细胞状态
- 健康状态是关键！
- 传代数≤20代，避免高代次影响增殖
- 贴壁细胞密度 70%-80% 时转染最佳（密度太高影响吸收，密度太低影响存活）
- 低血清或无血清培养（减少血清蛋白影响）
（3）转染试剂与DNA比例
转染试剂和DNA的最佳比例需要优化：
- Lipofectamine 3000：DNA: 试剂 = 1:2-1:3
- PEI：DNA: 试剂 = 1:2.5-1:4
- 电转：DNA浓度控制在1-10 µg/100 µL
💡 优化小技巧：
- 试剂-DNA混合后，室温孵育 15-20 min 让复合物形成
- 缓慢滴加 转染复合物，避免局部浓度过高导致细胞毒性
- 使用Opti-MEM培养基 进行转染，提高效率
3. 提高转染效率的进阶技巧
💡 （1）优化培养基
- 去除抗生素（如青霉素/链霉素），防止影响细胞摄取DNA
- 低血清培养基（如Opti-MEM）可减少蛋白对转染复合物的干扰
- 转染6小时后换新培养基，减少试剂毒性
💡 （2）使用增强试剂
- Lipofectamine 3000 + P3000增强剂 → 可显著提高转染效率
- 聚合物修饰的PEI（如jetPEI） → 降低毒性，适合基因编辑
💡 （3）温度 & CO₂控制
- 37℃ 5% CO₂ 恒温培养，避免温度波动影响细胞状态
- 避免长时间光照，荧光标记的核酸可能降解
4. 如何评估转染效果？
（1）荧光显微镜
- 如果携带 GFP/mCherry 报告基因，可用荧光显微镜直接观察
- 常用于粗略评估转染效率（定性分析）
（2）流式细胞术（FACS）
- 统计荧光细胞的比例，提供精确的转染效率数据
- 适用于高通量实验
（3）Western blot
- 用于检测外源蛋白表达
- 适用于非荧光报告基因的表达检测
（4）qPCR
- 用于mRNA表达检测，评估转染后基因表达水平
- 可定量分析 siRNA、shRNA 或 miRNA 干扰效果
5. 处理常见转染问题
| 问题 | 可能原因 | 解决方案 |
|---|---|---|
| 转染效率低 | 细胞密度过低/过高、DNA纯度低、培养基影响 | 细胞密度优化至70-80%，DNA 纯化，使用 Opti-MEM |
| 细胞死亡率高 | 试剂浓度过高，毒性过大 | 降低转染试剂用量，6小时后更换培养基 |
| 蛋白表达水平低 | 外源DNA拷贝数少，表达启动子不活跃 | 使用高表达启动子（如 CMV, EF1α），提高 DNA 浓度 |
| siRNA干扰效果差 | siRNA设计不佳，RNA降解 | 选择高效 siRNA，使用 RNase-free 试剂 |
| 无荧光信号 | 质粒构建错误，细胞摄取失败 | 检查质粒序列，增加转染剂量 |
6. 总结
💡 细胞转染关键点： ✔ 选对方法（脂质体/电转/病毒）
✔ 优化细胞状态（70-80%密度、低血清培养）
✔ 优化DNA质量和浓度（无内毒素，高纯度）
✔ 增强策略（P3000、jetPEI、温度/培养基优化）
✔ 检测方法（荧光、FACS、WB、qPCR）
做好这些，轻松提高转染效率，确保实验成功！ 🚀
2025年3月14日 15:30
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